浅析细菌培养与肺炎的关系：用痰标本进行肺炎的病原学诊断？
浅析细菌培养与肺炎的关系
肺炎是常见的感染性疾病。病原种类众多，微生物学检查的标本种类也很多。最佳标本是支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织，不过因为是侵袭性方法，国内很少应用。本文仅讨论咳痰或抽吸痰标本。痰是国内诊断肺炎以及多数临床细菌学实验室的最常见标本。用痰标本进行肺炎的病原学诊断––这是一个极具争议的话题。常见两个极端观点，或者把实验室分离株直接当做病原，一律进行抗菌治疗；或者认为咳痰的分离株全无意义，不必任何分析和处置[1]。前者肯定错误，因为口咽部定植污染，常识判断就可以否定。后者是否错误？国际上是否已经将痰标本废弃了呢？美国近期调查显示，就普通肺炎而言，依据指南需要留取呼吸道标本进行病原学检查时，有23%患者留取了痰标本，有18%结果对治疗产生了影响[2]。由此可知，上述两种极端观点都不可取。笔者认为，痰细菌培养对于肺炎病原学诊断而言，有价值––价值明确，但有限。
本文作者宁永忠的著作
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集锦：血气分析，21篇
一、痰细菌培养是肺炎病原学诊断诸多检查之一
肺炎的病原种类众多，细菌、病毒、真菌、寄生虫等4大类病原都有涉及。多种病原、多种标本结合多种检测技术，使得肺炎的病原学诊断不可能依靠单一手段完成。因此，痰细菌培养是肺炎病原学诊断的诸多检查之一，而非唯一。
病毒、寄生虫类病原不会在细菌培养基上生长。医生在开具痰培养医嘱的那一刻，应该同时考虑真菌和寄生虫感染的概率、病毒感染的取证等问题。比如最后证实为病毒性肺炎，苛责痰细菌培养阴性或阳性都没有意义。阴性理所当然；当然阳性有干扰，本文后续会提到，阳性需要分析。
仅就细菌性病原而言，临床也要知道，比如常见的病原肺炎支原体不会在普通培养基上生长。所以，痰细菌普通培养有明确的分离株种属范围。超出了这个范围，就超出了痰细菌培养的能力范围。临床需要按照肺炎病原谱，把痰培养不能分离的微生物(如病毒)，痰标本需要特殊定向培养才能分离的微生物(如结核菌、军团菌、支原体、考克斯体等)，痰标本普通培养即可分离的微生物(如肺炎克雷伯菌等)进行分类，这样有利于后续判断。
二、肺炎临床诊断成立是痰培养的前提之一
肺炎临床诊断包括：患者肺部(以及全身相应的)症状、体征、影像学检查(新出现的或逐渐加重的肺部浸润影)[3]。专业角度看，影像学检查是肺炎诊断所必须。而国内实践容易忽略影像学。另外，诊断肺炎时，要注意除外肺部肿瘤、非感染性肺间质性疾病、肺水肿、肺不张、肺栓塞、肺嗜酸粒细胞浸润症、肺血管炎等非感染性疾病[4]。实际工作中最开始送检痰培养的时刻，多数患者没有最后确诊。所以最终确诊为非感染性疾病而之前送检了痰培养的情况，无论有无分离株，都不应该纳入肺炎时痰标本作用的分析。原因即没有检查前提。实际工作甚至有诊断为心力衰竭、心肌梗死的患者进行痰培养，这无疑是错误的，也是因为前提不成立––即没有适应证。没有感染这个前提，进行痰培养作用判断是徒劳而没有意义的。
没有适应证而送检痰培养，实验室可以拒收。不拒收会导致工作量增加，阳性率下降，对结果出现误解和误导等。坚持拒收，则可以正本清源，减少不必要的消耗。
三、实验室处理的相关信息
1．标本：
应该新鲜，立即送检、立即处理。陈旧标本中白细胞(WBC)及一些菌体会溶解，杂菌过度生长会干扰结果判断。对痰普通细菌培养，实验室接到标本后需要进行质量判断。质量判断不合格，不必进行后续微生物学检查，标本拒收。一些特殊病原检查，比如结核菌或军团菌培养，不必进行质量判断。合格标本不必洗痰。有条件时，建议对痰标本进行液化处理，建议同时涂片。接种时不建议定量培养，规范半定量培养即可，参见卫计委行业标准《下呼吸道感染细菌培养操作指南》。
2．涂片：
专业而言，每1份进行痰细菌培养的标本都应该进行涂片镜检。注意这里指检查细菌和真菌，不是质量判断。国内实际情况涂片是临床医嘱，如果医嘱不到位，很多医院限于人力和收费，没有进行涂片检查，这是管理漏洞，也是专业漏洞。当然也不要走到另一个极端。重涂片而轻培养。涂片与培养是各自独立的不同检查，彼此都不是对方的前提，二者互为补充，结果要综合分析。
有涂片时，注意观察菌体(染色、形态)，炎症细胞，菌体与炎症细胞二者关系，组织细胞，其他特征性形态等。观察到PMN(多形核粒细胞)中吞噬菌体现象是重要的感染特征。
革兰染色后吞噬现象的观察和判断需要注意：要区分并排除黏附现象；吞噬后菌体的染色、形态不完全等同于未被吞噬的菌体和纯培养的菌体；吞噬的菌体判断无法指向菌种；吞噬菌体与培养分离株建立关联时，要没有歧义(比如吞噬是革兰阴性杆菌，形态符合肠杆菌科。但培养有大肠埃希菌、阴沟肠杆菌相同多量生长，此时即歧义，因为无法确知吞噬的是什么，还是都有吞噬)。一般而言，除了极其特殊的情况外(比如男性生殖道分泌物革兰染色查见胞内的革兰阴性肾形双球菌)，通过革兰染色镜下形态学识别进行菌种层面判断甚至临床确诊，属于常识性错误。
3．特殊的定向培养：
此时临床目的明确(比如结核分枝杆菌)，需要特定的培养条件(特殊培养基、气体、温度、时间等)。如果条件满足，有分离株则一一判断、鉴定，有目的菌种则报告阳性。无生长或没有目的菌种，则报告阴性。
4．咳痰和抽吸痰标本：
不能做厌氧菌培养。
5．口咽部正常微生物群：
美国《临床微生物学操作规程(CMPH)》2007版(3.11.2.9)提到草绿色链球菌群、普通定植的奈瑟菌属、脑膜炎奈瑟菌、假白喉棒杆菌、血浆凝固酶阴性葡萄球菌(SCN)、罗氏菌属(Rothia)、F群链球菌、厌氧菌、嗜血杆菌属(不包括流感嗜血杆菌。原文"不包括"，其实该菌可以正常定植)、肠球菌属、假丝酵母菌属、艾肯菌属、放线杆菌属(Actinobacillus)、二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)、莫拉菌属。
6．美国感染性疾病学会(IDSA)和美国微生物学协会(ASM)指南中的肺炎病原谱[5]：
社区获得性肺炎(CAP)：(1)细菌性：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肠杆菌科、铜绿假单胞菌、军团菌属、肺炎支原体、肺炎衣原体、混合厌氧菌(吸入性肺炎)、分枝杆菌(结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌)；(2)真菌：荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌(Coccidioides posadasii)、皮炎芽生菌；(3)病毒：流感病毒A/B、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒、副流感病毒1–4、人偏肺病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒；(4)寄生虫：卫氏并殖吸虫。
医疗保健相关肺炎(HCAP)、医院获得性肺炎(HAP)、呼吸机相关肺炎：(1)细菌：铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、粘质沙雷菌、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、混合厌氧菌(吸入)、军团菌；(2)真菌：曲霉菌属；(3)病毒：流感病毒A/B、副流感病毒、腺病毒、RSV。
免疫低下患者肺炎：(1)细菌性：见上面CAP和HCAP细菌性病原。额外需要考虑的细菌：沙门菌属(非伤寒菌)、脑膜脓毒伊丽莎白菌、单核细胞增生李斯特菌、奴卡菌和其他需氧放线菌、马红球菌、结核分枝杆菌、鸟胞内分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、快生长菌如脓肿分枝杆菌；(2)病毒：呼吸道病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒；(3)真菌：伊氏肺孢菌、新型隐球菌、曲霉菌属、镰刀菌属、接合菌(如根霉属、毛霉属、犁头霉属)，Pseudoallescheria boydii、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌、其他地方性真菌；(4)寄生虫：冈地弓浆虫、微孢子虫病(Microsporidiosis)病原Enterocytozoon bieneusi、隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)病原、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)。
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7．CMPH分离株生长判断方式[4]：
无生长：规范培养基和培养条件，连续72 h无任何肉眼可见菌落，这在临床是少见现象。毕竟口咽部大量正常微生物群存在。而合格标本意味着污染轻，并不意味着没有污染。此时要与临床沟通，看是否存在环节错误。
只有正常微生物群生长：呼吸道正常微生物群一般不鉴定。只有呈纯生长时，才鉴定和做药物敏感实验，无论多少(1＋～4＋)。注意纯生长极为罕见，实际工作需要确认纯生长是否是假象。比如选择培养基上的生长要小心，因为在普通羊血琼脂上可能有第2种菌生长。然后一区的判断要小心，因为可能有覆盖。
下列菌种正常情况下可以在上呼吸道定植，如果它们的生长等于或少于呼吸道正常微生物群的生长，一般视为定植。只有呈中重度生长(3＋或4＋)，并且多于呼吸道正常微生物群生长时，才鉴定和做药物敏感实验。包括：A群β溶血链球菌(化脓链球菌)、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、B/C/G群β溶血链球菌、棒杆菌属。
肠杆菌科分离株，1种或2种生长时，如果其生长等于或少于呼吸道正常微生物群的生长，则不必鉴定，除非患者处于免疫受损/抑制状态。如果呈中重度生长(3＋或4＋)，并且多于呼吸道正常微生物群生长时，则鉴定和做药物敏感实验。
下列革兰阴性杆菌只有1种生长时，无论多少，都要鉴定和做药物敏感实验。包括巴斯德菌属、铜绿假单胞菌、其他非发酵菌(支气管炎脓毒博德特菌、嗜麦芽窄食单胞菌、不动杆菌属、洋葱博克霍尔德菌等)。
如果上面两类革兰阴性杆菌中不同菌种呈混合生长，即3种或3种以上同时生长，如果其生长等于或少于呼吸道正常微生物群的生长，则不必鉴定。如果呈中重度生长(3＋或4＋)，并且多于呼吸道正常微生物群生长，则对最多的两种优势菌进行鉴定和做药物敏感实验。如果患者处于ICU或处于免疫受损/抑制状态，则都鉴定和做药物敏感实验(这不意味着优势菌必然是真正的致病菌)。
下列革兰阳性杆菌，无论多少，都要鉴定和做药物敏感实验。包括马红球菌(Rhodococcus equi)、需氧的放线菌(奴卡菌属、链霉菌属Streptomyces)。
下列真菌，无论多少，都要鉴定。包括新型隐球菌、非腐生性的丝状真菌(如曲霉菌属、毛霉属Mucor、引起系统性真菌病的菌种)。
为什么要把实验室判断方式呈现出来呢？因为实验室和临床医生都需要知道游戏规则。对于实验室而言，上述CMPH中的规则，可能很多细菌学工作者不甚明了。而对于临床医生则常常有很多困惑。比如SCN痰培养分离株为什么不做鉴定和药敏––这是我们常遇到的问题。通过上面的规则我们知道，除非是真正的纯培养，痰SCN分离株不必做鉴定和药敏。如果临床想知道SCN的情况，需要升级标本为BALF或肺组织，靠痰无法判断。再比如为什么有时候肠杆菌科不做鉴定和药敏，而有时候做––这也是我们常遇到的问题。不做的原因，或者是量非常少(几个菌落或1＋)，或者明显比正常微生物群少。
四、痰培养分离株对肺炎的诊断意义
1．明确菌种致病性：
临床分离株可以分为经典致病菌和条件致病菌。经典致病菌一般不是人体正常微生物群，在人体罕有定植，一经发现即是异常。如果有对应的临床表现，一般而言分离即可确诊。没有临床表现，存在也是重要的临床现象，要么是感染前的潜伏期，要么是隐性感染。如结核分枝杆菌、嗜肺军团菌。条件致病菌一般是人体正常微生物群，或可以在人体短暂定植。分离后可能不是感染。其分离株判断有一定难度，需要理解感染性疾病分级诊断。
2．感染性疾病的诊断分级：
包括拟诊断(possible，suspected)、极似诊断(probable，presumptive)、确定诊断(proven，definite，confirmed)[6]。三级诊断理念在病毒性疾病、真菌性疾病领域目前是业界热点，真菌学领域已经是指南基本理念。细菌性感染性疾病的诊断也可以分为三级[7]。极似诊断指两种情况：(1)临床表现不明确，但微生物学证据明确；(2)临床表现明确，但只有初步的微生物学证据。前一种情况一般是监测状态。后一种情况为临床多见，具体指征据本身可信，但尚未明确微生物种属，或检查结果阳性预测值(PPV)低[8]。中华医学会新版社区获得性肺炎(CAP)指南(即将发布)将微生物学证据(包括痰培养)分为：(1)可作为病原学确定诊断依据的检测结果；(2)对病原学诊断有重要参考意义的检测结果。第1点对应确诊，第2点对应本文的极似诊断。
痰涂片见到吞噬菌体现象––不能明确种属、痰普通半定量培养分离的条件致病菌––阳性预测值低(50%左右)，二者都是极似诊断层面证据。此时，分离的条件致病菌被称为可能致病菌(probable pathogen)。
3．极似诊断证据(条件致病菌/可能致病菌)本身的价值：
肺炎的临床表现分轻、中、重度。重症肺炎的判断方式见相关文献[3]。对于重症肺炎，一般在临床诊断确立后，先初步判断可能的病原。根据判断结果，一方面采集标本(呼吸道分泌物、血液、胸腔积液、尿液等)采用多种检查积极获得病原学证据(除细菌外，还包括病毒学和真菌学证据等)，另一方面基于严重程度根据可能的病原选择药物启动经验治疗。
而获得痰培养分离株种属信息，一般是在取材48 h后。此时经验治疗已经进行2 d。对于危重患者，应该已经进行了至少1次经验治疗疗效分析。而其他病原学检查结果也已经部分回报。如果48 h后仍未确诊(甚至还有其他病原学检查结果未知)，经验治疗疗效分析显示没有明显效果甚至病情进行性加重，经验治疗也没有覆盖痰培养分离株，则调整治疗需要覆盖该分离株。如果后续有其他明确的肯定性证据则确诊，治疗转换为靶向治疗。如果有明确的否定性证据，或其他停药指征，则停止针对性治疗。
这样是否会导致抗生素不合理使用？个人认为，如果危重判断明确有根据，经验治疗疗效欠佳而且没有覆盖，同时也在积极获得确诊的病原学证据这样的前提下，鉴于重症肺炎的病死率(CAP>30%，并发脓毒症则可达50%)，调整治疗先行覆盖是合理的。
4．将极似诊断证据确定为真正病原的方法：
(1)同时血培养(肺部是唯一感染源)或胸腔积液培养、之后的支气管肺泡灌洗液(BALF)培养，有相同分离株分离。(2)痰涂片见到吞噬菌体现象，与培养结果相符且无歧义。(3)肺组织病理学查见菌体，相符且无歧义。(4)免疫学(抗原等)结果相符。如尿液肺炎链球菌抗原检查阳性，而痰中有肺炎链球菌分离。(5)分子生物学：肺组织标本结果相符则可以确定。
注意：上面后两种情况可以直接到种属，分离株还有意义吗？––有意义，因为可以做药敏试验。此外，经验治疗有效后通过抗生素活性谱反推病原，这是错误的理念。尤其是广谱抗生素的情况，更是错误。
五、只有正常微生物群生长或无生长时痰培养的意义
痰培养如果只有正常微生物群生长，或无生长，而没有可能致病菌，一般认为是阴性结果。痰培养阴性的价值何在？在于其阴性预测值高。痰培养没有可能致病菌，如果此时临床仍然考虑肺炎，则可以重点关注痰培养无法分离的病原。比如病毒、支原体、衣原体、军团菌等。而仅仅针对痰培养可能致病菌的治疗，可以考虑终止。
六、实际工作中影响痰培养病原检出的因素
1．适应证：
逻辑上讲，适应证越宽泛阳性率越低。如果心力衰竭、尿路出血患者都送检痰培养，那阳性率必然低。所以严格控制适应证、控制分析前留取要求，会有痰标本量下降的现象[9]。
2．标本留取：
英国近期研究显示，由经过严格培训的护理人员深入辅助标本留取，送检合格率会有显著提高(40.5%升高到60.2%)[9]。由此可知，医嘱到位、专人辅助，会使得标本留取有显著改善。
3．抗生素使用：
抗生素应用会使阳性率下降，这是业界常识。原则而言，应该在抗微生物药物使用前留取微生物学检查标本。近期美国研究显示，对引起菌血症的肺炎链球菌肺炎的痰标本，抗生素使用后10 h内留取痰标本，标本阳性率没有显著下降[10]。这个结果提示我们，最佳选择是在抗微生物药物使用前留取标本。如果没有及时留取，用药后10 h内留取也可以接受。
4．质量判断：
普通痰培养之前需要进行质量判断。有时候可能多达30%的标本不合格。如果不做质量判断，或标准把握的宽松，则阳性率会下降。近期加拿大有文章对质量判断标准进行研究。结果显示，抽吸痰标本如果扁平鳞状上皮细胞<10/低倍镜视野，同时看见菌体则可能致病菌分离率在54%；如果未见菌体，则分离率仅有10%[11]。该结果提示我们菌体存在应该成为质量判断标准的要素之一。
5．实验室因素：
实验室客观条件、专业人员数量和素质，也会影响阳性率。这在国内尤其不乐观。
七、痰培养分离株确定为病原后的临床意义
培养分离病原是间接检查，其不同于直接检查之处在于可以基于分离的菌株进行进一步检测。包括检测药物耐药性[12]，为临床经验和靶向治疗提供依据；检测毒素判断菌株毒性[13]；检测型别判断菌株同源性等。这是临床微生物学不同于其他检验医学分支的地方，别具特色，深为临床关注。
综上，痰细菌培养是肺炎病原学诊断的诸多检查之一，而非唯一；肺炎临床诊断成立是痰培养的前提之一，不可忽略；痰细菌培养检出致病菌，可以确诊；痰细菌培养检出可能致病菌，是极似诊断证据，重症患者经验治疗无效时，需要覆盖；痰细菌培养阴性预测值高，可以除外相应感染；一系列因素影响痰培养阳性率，具体工作要具体分析；分离株确定为病原后可以进行耐药性等一系列间接检查。
未来趋势是以侵袭性手段采集标本为主，BALF会成为肺炎诊断的最常见标本。不过目前仍然是痰标本为主，所以对痰细菌培养与肺炎的关系加以厘清，仍具有一定的实际意义。
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